ŠĻą”±į>ž’ ©«ž’’’§Ø’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’ģ„Įc æljbjbšSšS ”<š1š1#’’’’’’]ōōōōōōōČČČČ8$$4Č!`l‚"¤¤¤¤¤¤6888888,ōuDd½ō¤¤¤¤¤dčōō¤¤lččč¤"ō¤ō¤6ąčąōōōō¤6čNč6ōō6X2²ČČĘ"6 DISORDER AT METAL SITES IN PROTEINS: A HIGH FREQUENCY EMR STUDY* Betty J. Gaffney‡, Brendan C. Maguire‡, R.T. Weber†† and G.G. Maresch†, ‡ ‡National High Magnetic Field Laboratory and Institute for Molecular Biophysics, Florida State University, 1800 E. Paul Dirac Dr., Tallahassee, Florida 32310; and †Bruker Analytik , Germany; and ††Bruker Instruments, USA running title: High Frequency EPR of Metal Ions in Proteins address correspondence to: Betty J. Gaffney, National High Magnetic Field Laboratory, Florida State University, 1800 E. Paul Dirac Dr., Tallahassee, Florida 32310 * presented at: International Expert's Workshop on the Present and Future of HF EPR Instrumentation, Illinois EPR Research Center, University of Illinois at Urbana-Champaign, March 1-2, 1998 ABSTRACT High frequency EMR of metalloprotein samples offers considerable potential for providing improvements in characterization of metal centers. For those metal ions that are studied at low temperature, linewidths may be frequency dependent, depending on the terms that limit the widths. Here we examine apparent EMR line widths and line shapes in some representative metalloprotein samples at two frequencies: ~9.2 GHz (X-band) and ~94 GHz (W-band). Samples of the same size were measured at both frequencies. The samples include cupric ion in lactoferrin, high spin ferric ion in diferric transferrin and high spin ferric heme in catalase. For the approximately ten-fold increase in EMR frequency, the observed line widths increased ten-fold or less for the samples chosen. Distributions in one or more spin Hamiltonian parameters can account for these line width dependencies on EMR frequency in the lactoferrin and transferrin samples, while molecular heterogeneity is a likely contributor to the catalase frequency-dependent linewidth. These measurements over frequencies differing by a factor of ten also contributed new insight for simulation of the EMR spectra of di-ferric transferrin. Electron Magnetic Resonance (EMR) spectra of metalloproteins in crystals or frozen solutions show strong sensitivity to small structural changes near the metal sites. Multiple sites, or distributions of them, are evident in the EMR spectra obtained at low temperatures where the sample state is a frozen aqueous solution, with or without cryoprotectants [1]. The origin of the multiple sites is of interest because in some cases it can be attributed to conformational flexibility, or to equilibria, in a metal ion environment [2, 3]. Understanding the origin of line widths in the EMR spectra contributes to interpretations of this kind. Experiments by continuous wave (cw) EMR at two frequencies, ~9.2 GHz (X-band) and ~94 GHz (W-band), were conducted to examine the apparent frequency-dependence of EMR line widths of representative metalloproteins. The samples in small capillaries for W-band measurements were also used to obtain the X-band spectra, so that a qualitative comparison of the response to the same number of spins could be made for the two spectrometers. In low temperature EMR measurements of metal ions in proteins, distributions in effective g-factors (g-strain) or in zero field splitting parameters frequently determine the observed line width. A number of other factors may contribute to the line shape also, so that the apparent line width dependence on frequency of measurement may be greater than, or less than, linear with frequency within a given range and at a given temperature. In the simplest case of a "g-strain" dominated shape, line widths increase linearly with the frequency of measurement. A simple statement cannot be made about the effect of distributions in zero field splitting on frequency dependence of line widths, but the increase in width of high-spin ferric metmyoglobin EMR spectra between 1 and 285 GHz has been studied in detail [4, 5] and the higher frequency linewidths have been attributed to g-strain and to distributions in zero field splitting. Another possible contribution to linewidths is from so called "looping transitions". Looping transitions occur when energy levels have avoided crossings, a case that is found when the microwave frequency is on the order of zero field splittings. In these transitions, the separation of levels near a resonance does not diverge with field, and the line width is so broad that the transition at selected angles in an oriented sample may actually disappear [6]. At the other extreme, when the operating frequency is much greater than the zero-field splitting in an S>1/2 system, observed line widths may decrease relative to those at lower frequency because distributions of zero-field parameters contribute to a decreased extent. This effect has been seen in Mn+2 samples and has been used to an advantage in identifying oxygen (17O) ligands to manganese in a protein by EMR at 140 GHz [7,8]. Increases in spectral resolution with increasing frequency are also observed when dipolar, or other field-independent terms, dominate the line shapes in the low-frequency spectra [9]. It is the purpose of this paper to examine the frequency dependence of apparent EMR line shapes for representative metal ion sites in proteins over the decade in frequency from X- to W-bands. The three metalloproteins employed in this study are di-cupric lactoferrin, di-ferric transferrin and bovine liver catalase. Copper lactoferrin has been the subject of numerous EMR [10] and x-ray crystallography studies [11]. The two copper binding sites have slightly different symmetry [11]. The line widths of this copper protein have been studied carefully at three low frequencies (2-9 GHz), so that an extrapolation to the W-band frequency can be made and tested. Ferric holo-transferrin has overall structure similar to that of lactoferrin. The iron binding sites each contribute two-components to the EMR spectra, which, at X-band, have been the subject of analysis by simulation [12]. It was concluded that the apparent breadth of the X-band line shapes ( 80-500 MHz) arises from distributions in zero field splittings. Recently, the relaxation times of ferric transferrin complexes were measured directly and the results indicated that the relaxation-determined line widths were 1 MHz or less in the range 5 to 30 K, confirming that the apparent shapes are not relaxation determined [13]. The zero field splitting of ferric iron in transferrin is on the order of the X-band quantum (0.3 cm-1) [14,15], so substantial differences in shape and effective g-values are expected between X- and W-band spectra. Lastly, catalase was chosen as an example of a heme protein containing high-spin ferric iron. Little shift in g-values for the features of EMR of heme proteins are expected between X- and W-band because the zero-field splittings for heme are relatively large (7-10 cm-1). Information on frequency-dependence of line widths was obtained in a study, at EMR frequencies from 70 to 372 GHz, of another heme protein, high spin methemoglobin [16], and at 1-285 GHz of metmyoglobin [5]. Although the data of the earlier paper were interpreted as a linewidth dependence on the square of the frequency [16], the more recent study of metmyoglobin concludes that at least three different line-broadening mechanisms prevail in different ranges of EMR frequency [5]. MATERIALS AND METHODS Copper lactoferrin was prepared either from human apolactoferrin (Sigma, St. Louis) or from the apoprotein made by dialysis of human ferric-lactoferrin (Calbiochem, San Diego) into 2 changes of 100 volumes of 0.1 M citric acid, pH 2.0 to remove iron [17]. Natural abundance copper (0.9 to 1.1 equivalents per metal ion site, see text) was added as the nitrate salt (1 mM) to 0.24 mM apo-transferrin in buffer A ( 25 mM TRIS-HCl, 0.1 M potassium chloride, 50 mM sodium bicarbonate, pH 7.4). For substitution of 65Cu, copper oxide (Isotec, Miamisburg, OH) was dissolved in 0.1 M HCl to give 10 mM 65Cu-cupric chloride and 0.9 equivalents per metal ion site were added to 0.24 mM apo-transferrin. Excess metal ion was removed by passing the solution through a Chelex column (Biorad, Hercules, CA), followed by dialysis overnight into buffer A; and the sample was concentrated (Minicon B15; Amicon, Beverly, MA) to about 2 mM in protein (4 mM in copper). Di-ferric transferrin was obtained from Sigma as the holo-protein and was dissolved in buffer A, passed over Chelex and concentrated, similarly to the preparation of cupric-lactoferrin. Bovine liver catalase as a precipitate (Sigma) was used directly for EMR studies. Lactoferrin and transferrin samples were concentrated 2-3 times for EMR studies when 0.1 to 0.5 ml of the protein (~2 mM) in buffer A was dialysed against two changes of 40 volumes of a 1:1 (v:v) mixture of glycerol and buffer A. They were loaded by syringe into quartz capillaries of 0.9 mm OD, 0.5 mm ID (Wilmad, Buena, NJ), closed at one end. Catalase samples were loaded into the capillaries as a suspension and the precipitate was concentrated at the bottom of the tube using a table-top centrifuge, and the excess liquid was removed. The tops of all EMR capillaries were sealed. For X-band measurements, the 0.9 mm capillaries were placed within a thick-walled 3 mm quartz tube. W-band spectra were recorded in Tallahassee during and after installation of a Bruker ELEXSYS E 600 cw EMR system (Bruker Analytik, Karlsruhe, Germany) operating at a resonance frequency of 94 GHz. The heterodyne microwave design uses an intermediate frequency at X-band. The resonator is a TE011 cylindrical cavity. The magnetic field was generated by a 6T split-coil superconducting magnet (Bruker-Magnex, Karlsruhe, Germany and Abingdon, UK ). Spectra were obtained with sweeps of the superconducting magnet; and a "current jump method" was used to obtain linear field sweeps [18]. The accuracy of the magnetic field was determined by recording the spectra of a manganese oxide standard, or the sample, with increasing and decreasing field sweeps under the conditions of each experiment. Temperature was controlled and measured with an Oxford Instruments ITC503 temperature controller equipped with an automatic gas flow controller ( Oxon, UK). Values of "g" cited in the discussion are effective g-values calculated using geff = hnš / bšeBres where Bres is the field at which a spectral feature is observed. X-band EMR measurements were conducted on a Varian E-109 equipped with a standard E231 rectangular cavity and an Oxford ESR 9/10 cryostat and manual transfer line and flow controller. Simulations of spectra for S=5/2 spins were made on a Silicon Graphics Unix system using a FORTRAN program developed by Gaffney and Silverstone [1,6], and earlier by Yang [12] and with modifications by Doctor [19] and Maguire [20]. The effects of distributions in zero-field splitting parameters E or D were calculated separately assuming a Gaussian distribution in either parameter. Widths of distributions reported here are half widths. Calculations of the populations of different levels included transition moments and Boltzmann factors. Both temperature and magnetic field contribute to the Boltzmann factor. As a consequence, in the calculations using parameters that characterize the ferric centers in transferrin, the Boltzmann populations of levels at a resonance are nearly equalized at X-band while the lower levels have a significant preponderance of population at W-band. RESULTS AND DISCUSSION EMR spectra of di-cupric lactoferrin at 40 K were obtained at X- and W-band frequencies (Figure 1) using a sample contained in the same small capillary for both measurements. The g-parallel and g-perpendicular regions are widely separated at W-band (94.14 GHz) and splitting by the copper nucleus is resolved in the g-parallel region. In the sample containing natural abundance 65Cu (31%) and 63Cu (69%), the W-band spectrum displayed g-parallel peaks at 2.9364, 2.9215, 2.9070 and 2.8916 ± .001 T (average hyperfine separation 14.9 mT). The assignments are consistent with values of A|| measured by others at X-band for di-cupric transferrin with isotopically pure copper isotopes (63Cu: A|| = 14.5 mT and 65Cu: A|| =15.6 mT) [21] and with the isotope ratios. The pattern in the g-parallel region of the W-band spectrum can be simulated as the sum of Gaussian lines of full-width-at-half-maximum (FWHM) of 11.0 to 12.0 mT, the mI =±1/2 lines being slightly narrower than the mI =±3/2 lines. An analysis [10] of EMR line shapes measured for copper transferrins at 2-9 GHz yielded a value of the distribution in g-values ("g-strain") of 0.0102 and a residual line width of 0.53 mT. Based on the low frequency experimental spectra of di-cupric transferrin [10], the line width (FWHM) predicted at g|| for 94 GHz is given by equation (1) and is ~12.5 mT for the mI -1/2 line. In equation (1), öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööDšHR1/2 šis the residual line width, and "corr." is the correlation term between the uncertainties, sš, in A|| and g|| [10]. (DšH1/2)2 = (DšHR1/2)2 + (mI sšA|| )2 + (sšg|| / g|| " Bres)2 + (corr.) (1) = [(0.53)2 + (mI " 0.8)2 + (12.8)2 - (mI " 175.6)] (mT)2 The slightly narrower than predicted lines observed in this study may mean that sšg|| is smaller for lactoferrin compared to transferrin or that the presence of 50% glycerol in the sample results in less distortion in low-temperature samples. A sample of 65Cu-lactoferrin was prepared using slightly less than saturating copper for two sites and the result is shown in the g-perpendicular inset of Figure 1 (W-band). (Sub-stoichiometric amounts of copper ion give a spectrum free of the high field shoulder in the g-perpendicular region that arises from copper ion in buffer A.) The gx = 2.052 and gy = 2.058 (± .001) features are clearly resolved in the W-band spectrum. A striking aspect of the comparison of X- and W-band spectra of di-cupric lactoferrin is the shift of the spectrum of a small amount of Mn+2 impurity to a field that is completely separated from the copper signal, because of g-factor differences. Passing samples over Chelex was not adequate to remove the manganese. Some of the early analyses of copper transferrins led to the suggestion of more than one nitrogen ligand to the metal ion, although it is now known from low-frequency EMR [10] and from x-ray structure analysis [11], that the metal is coordinated to only one histidine. Manganese impurities make analysis of the g-perpendicular region of X-band copper EMR spectra difficult, but do not complicate W-band spectra. On the other hand, at the higher frequency, contributions of g-strain to the line width obscure nitrogen hyperfine and g-perpendicular, copper-nucleus hyperfine information. Di-ferric transferrin has been the subject of many EMR studies. Analysis of the sharp features at ~g=4.3 in the X-band spectra, together with spectra at Q-band (35 GHz), give an estimate of the value of the zero field splitting parameter, D, of about 0.25 cm-1 for this sharp component [14]. Mössbauer studies lead to a similar conclusion [15]. Details of the EMR spectra vary with changes in salt or glycerol in the solvent, and substantial changes are seen when the synergistic anion is changed from carbonate to oxalate or other bidentate chelators [22]. The breadth of the spectra at X-band of di-ferric transferrin has been attributed to distributions in zero-field splittings [12]. W-band spectra of di-ferric transferrin carbonate are expected to be shifted toward g=2 because the value of D is smaller than this operating frequency. This effect is illustrated by the experimental spectrum shown in Figure 2. The region of the largest signal at W-band is centered around g=2, although shoulders are evident at higher and lower fields in spectra extending over a wider field range (see Figure 4). The three major features in the W-band spectrum, at ~ 3.260, 3.336, and 3.540 T, and the features in the inset of the X-band spectrum, correspond to transitions within a middle Kramers doublet, although gx, gy and gz are not exactly at these turning points because of the interplay between Zeeman and zero field splitting terms in the energies. The X-band spectrum is dominated by the g ~4.3 feature. The spectrum shown was recorded using the small sample tube employed for W-band, so the broad peaks at low field are not evident. However, X-band EMR of larger samples reveals two peaks at low field (g ~ 8-9) corresponding to transitions between the levels of the lowest Kramers doublets of two ferric sites that differ in zero field splitting parameters [12]. To assign the major features of the W-band EMR spectrum of di-ferric transferrin carbonate, spectra were simulated and the simulations were compared to an experimental sweep of the di-ferric transferrin signal from 2 to 5 T (Figure 3). Maxima and minima in the experimental spectrum of Figure 3 are at approximately 2.8 (max, broad shoulder), 3.2 (max), 3.4 (min), 3.54 (min), 3.7 (min), 3.9 (min) and 4.5 (min, broad shoulder) Tesla. Earlier simulations of X-band EMR of di-ferric transferrin carbonate indicated that one of the components had E/D ~1/3 and De" 0.23 cm-1[12]. Simulations fit the W-band spectra only if the value of D is taken somewhat higher than 0.23 cm-1. The steps in assignment of the features in the experimental spectrum of Figure 3 are outlined in Figures 4-7. The spin Hamiltonian used to describe this system is given in (2). Using the coordinate system indicated by this Hamiltonian, the range of E/D values is zero to 1/3 [1]. In some cases shown below, values of E/D outside of this range are used. Doing this is equivalent to reassigning the x-, y- and z-axes. For instance, the calculated spectra are identical for D=0.3 and E=0.12 cm -1 (E/D=0.4), or for D=-0.33 and E=-0.09 cm -1 (E/D=0.272).  EMBED "Equation" \* mergeformat  (2) In referring to the simulations, the six energy levels for the high-spin ferric system are numbered from lowest to highest in energy as levels 1 to 6, respectively. The most prominent experimental features at ~3.2 (max), 3.4 (min), 3.54 (min) T arise from transitions between levels 3 and 4. The field separation of these features is an excellent indicator of the D-value, but the details of this region of the spectrum point to a distribution in the value of E. Figure 4 shows a series of calculations for the central region of the spectrum shown in Figures 2, with varying widths of distributions around a central zero field splitting parameter of E=0.0933 cm-1 and with D fixed at 0.28 cm-1. Note that, in Figure 4, two of the maxima apparent in the spectrum with no distribution (upper) are missing from the lower spectra calculated with distributions in E. These maxima arise from part of the transition between levels 2 and 3 and the resonance fields for this transition are more sensitive to the value of E than are the resonance fields of the 3 to 4 transition. Simulations with a distribution in D instead of E (not shown) also broaden the part of the spectrum from the 2-3 transition, but have only a small effect on the shape of the 3-4 transition. Thus, although the central region of the spectrum allows the value of D to be estimated, it contains relatively little information about a distribution in D. Note also, that the spectrum around 3.35 T is slightly distorted by a background maganese ion signal. There may also be some residual rapid-passage contribution to the same region of this experimental spectrum taken at 40K; spectra of transferrin carbonate at 5K are absorption-like because of strong rapid passage effects. Although the middle region (near g=2) of the ferric transferrin spectrum is relatively insensitive to D-distributions, the broad absorptions flanking this region contain a wealth of information about both D and E. Figure 5 gives the calculation shown in Figure 4 (distribution in E of 0.0224) over the wider field range covered by the experimental spectrum in Figure 3. The Gaussian distribution in E was calculated with eleven individual spectral components. This distribution is coarse and the individual components can be distinguished in regions of the calculation around 2.2, 2.75, 3.9 and 4.5 T. One notes immediately that the simulation has sharp features that are absent from the experimental spectrum. This suggests that a distribution of D-values, as well as of E, characterizes the experimental spectrum. To illustrate this point, the lines drawn above and below the calculated spectrum mark the resonance fields that would be observed for various combinations of E and D. A closer view of these lines is given in Figure 6, where the maxima or minima in transitions between the designated pair of energy levels is presented for eleven separate values of E at four different values of D. Transitions between two pairs of levels contribute to the high- and low-field regions illustrated. On the low-field side, the 4 to 5 transition is relatively invariant with E and contributes the sharp feature in the calculated spectrum that only used a distribution in E. On the high field side, the sharp feature is from the 2 to 3 transition. The reason that certain regions of these transitions are insensitive to E is that the magnetic field is along the z-axis of the D tensor in those regions. This angular dependence is illustrated in Figure 7 where the resonance field as a function of polar angle, theta, is shown for various values of phi from 0 to 90 degrees. Finally, the calculations in Figure 6 are used to estimate that the experimental spectrum has the characteristics, not only of a distribution of E of about± 0.02 cm-1, but also a D-distribution of about the same magnitude. There are two peaks in the experimental W-band spectrum shown in Figure 2 at ~3.2 and 3.7 T that are missing in the calculated spectrum centered around D= 0.28, E=.0933 cm-1 (Figures 4 and 5). These features can be generated with a simulation centered around E/D = 1/3 and with D = 0.37 cm-1 and distributions similar to those used for the major component. The earlier analysis [12] did conclude that there were two components (one minor) with E/D near one third, but it would have been impossible to obtain evidence for a value of D as high as 0.37 cm-1 from X-band measurements alone. On the other hand, the earlier analysis concluded that there was a second major component with E/D ~0.22 cm-1. Although a simulation with this value of E/D and other parameters from the earlier analysis did not provide a good fit to the center of the spectrum (Figure 4), the possibility of a component with a ratio of E/D near 0.22 cm-1 cannot be entirely ruled out with the limited data available. In summary, W-band spectra of di-ferric transferrin carbonate are in reasonable agreement with earlier assignment of the major component in the X-band spectra [12], although the W-band data suggest that one, and possibly two, components in the spectrum have a larger value of D than previously recognized. Catalase, as an example of a heme protein, also has been examined at both frequencies and at a temperatures from 8 to 40K. The low-field region of the W-band spectrum (0.5-1.5 T) of catalase was measured in several ways, including sixteen scans of accumulation with the field running alternately up and down. The latter experiment was run as a test of magnetic field control, and during the averaging, no increase in width of peaks was observed. The W-band EMR spectrum shown in Figure 8 was obtained in a single scan and was filtered by averaging 4 adjacent points. The ranges of the X- and W-band spectra shown represent almost the same range of g-values and, with this scaling by g-factor, the spectra look very similar. The two major peaks in the portion of the spectra shown are at the gy - and gx -values in spectra arising from a D-value larger than either operating frequency and with symmetry near axial (E/D = 0.021). (For reference, high spin methemoglobin has a more axially symmetric heme center and displays a single peak centered between the two catalase peaks.) Many catalase samples are known to contain damaged hemes [23, 24] and this probably accounts for the minor peaks at lower field in spectra at both frequencies. In spectra at X-band, taken at 10K, the apparent line width at gy is of 2.0 mT outer-half-width at half-height. The inset in Figure 8 shows how the X-band EMR linewidth changes with increasing temperature. These data indicate that the linewidth probably is relaxation-determined at the higher temperatures, which is consistent with studies of relaxation in other high-spin heme systems [25]. Assuming this is true for the temperature range 40-100K and that modulation of zero field splitting is the dominant relaxation mechanism, a crude lower bound of D~7 cm-1 can be estimated from the temperature dependence of the line width. The apparent outer-half width at half-height of the W-band spectrum recorded at 10K is approximately 26 mT, although since at least 3 overlapping components are evident in the spectra, this is only a rough measure. This width is roughly constant in W-band spectra between 8 and 40K. The W-band spectrum of catalase exhibits slightly better resolution of the components contributing to the lineshape than was obtained at X-band. Possible general reasons for increased resolution at high frequency might include a decreased contribution of spin-spin interaction and separation on the basis of D-value. Contributions to the linewidth from spin-spin interactions between hemes in the catalase tetramer are expected to be small because the inter-heme distances from the x-ray structure are 31.2, 45.5 and 34.6 Å [23]. A mixture of samples with D- or E-values that give slight shifts in effective g-values at high frequency is a more likely interpretation of the frequency dependence of the catalase line shapes. Calculations of spectra for E/D = 0.021, with differing D and corresponding E values, indicated that detectable shifts in line positions at W-band, compared to X-band, occur when the value of D is about 8 cm-1 or less for a spectrum with the linewidth observed. Differences in zero field splitting parameters may arise from heme heterogeneity or from the known pH sensitivity of catalase EMR spectra coupled with pH variation on freezing of samples [26]. Resolution of multiple components in X- and Q-band EMR of catalases from other sources has been observed [e.g. 27, 28]. SUMMARY AND CONCLUSION Table 1 gives a summary of the observed line widths of the samples studied at X- and W-band frequencies. For copper lactoferrin , the observed widths increased approximately linearly with field, as expected for a case of strain in g-factor . The increase in apparent line width of features in the di-ferric transferrin spectra was only a factor of four in W-band spectra compared to the width of comparable features in X-band spectra. For ferric transferrin, the D-value is such that the contributions from zero field terms in the Hamiltonian, relative to the Zeeman term, are diminished at W-band compared to X-band. Therefore, the distribution of zero field terms contributes less to observed line widths as the frequency is increased. It is likely that line widths in ferric transferrin EMR spectra would decrease further at several times the W-band frequency, an effect similar to that observed for protein-bound manganese ion at 140 GHz[7]. The width of the low field signals from catalase increased approximately linearly with frequency, but no significant shifts in effective g-values were observed, indicating that the lower bound to D for this system is about 8 cm-1. At the higher frequency, some resolution of individual components in the lineshape was observed. Possible origins of the separate components include the known sensitivity of catalase spectra to pH [26] and the presence of a significant population of broken heme rings [23,24]. Data at 94 GHz have contributed to improvement in the earlier simulation of spectra of ferric transferrin. Major features in the spectra are consistent with D=0.28 cm-1 and distributions in E and D. Plots that are shown in Figure 5 and 6, of variation in resonance field for differing D and E, can be used to simplify future calculations of the effects of distributions in these parameters by taking a linear prediction approach. More exact parameters that provide a fit to the transferrin carbonate spectra can be obtained when anisotropy in the Zeeman term is determined experimentally, for instance by very high frequency EMR, and when EMR single crystal data for this protein are obtained. ACKNOWLEDGEMENTS The support of this work by NIH grant GM36232 (B.J.G.) is gratefully acknowledged. REFERENCES [1] Gaffney B. J. and Silverstone H. J. (1993) in Biological Magnetic Resonance,: EMR of Paramagnetic Molecules, (L.J. Berliner and J. Reuben, Eds), vol. 13, ch. 1, pp. 1-57 N.Y.:Plenum, 1993. [2] Yang A.-S. and Brill A.S. : Biophys. Chem. 58, 341-354 (1996). [3] Force D.A., Randall D.W., Britt R.D., Tang, X.-S. and Diner B.A.: J. Am. Chem. Soc. 117, 12643-12644. [4] Fiamingo, F.G., Brill A.S., Hampton D.A. and Thorkildsen R.: Biophys. J. 55, 67-77 (1989). [5] van Kan P.J.M., van der Horst E., Reijerse E.J., van Bentum P.J.M. and Hagen W.R.,: J. Chem. Soc.94, in press (1998). [6] B.J. Gaffney B.J. and H.J. Silverstone H.S.: J. Magn. Res., accepted . [7] Bellew B.F., Halkides C.J., Gerfen G.J., Griffin R.G. and Singel D.J.: Biochem. 37 12186-12193 (1996). [8] Halkides C.J., Bellew B.F., Gerfen G.J., Farrar C.T., Carter P.H., Ruo B., Evans D.A., Griffin R.G. and Singel D.J.: Biochem. 37 12194-12200 (1996). [9] Zhou D. and Kreilick R.W.: J. Magn. Res. 108 93-95 (1994). [10] Froncisz W. and Aisen P.: Biochim. Biophys. Acta 700 55-58 (1982). [11] Smith C. A., Anderson B.F., Baker H. M., and Baker E. N.: Biochem. 31 4527-4533 (1992). [12] Yang A.-S. and Gaffney B. J. :Biophys. J. 51 55-67 (1987). [13] Gaffney B.J., Eaton G.R., and Eaton S.: J. Phys. Chem. in press.. [14] Aasa R.: J. Chem. Phys. 52 3919-3930 (1970). [15] Kretchmar S.A., Teixeira M., Huyhn B.-H., and Raymond K.: Biology of Metals 1 26-32 (1988). [16] Alpert Y., Couder Y., Tuchendler J. and Thomé H.: Biochim. Biophys. Acta 322 34-37 (1973). [17] Ainscough E.W., Brodie A.M., Plowman J.E., Bloor S.J., Loehr J.S. and Loehr T.M.: Biochem. 19 4072-4079 (1980). [18] Maresch G.G.: EleXsys User's Manual, Bruker Analytik (1997) pp. 67-71. [19] Doctor K.S. and Gaffney B.J.: Appl. Magn. Res. 11 425-435 (1996). [20] Maguire B.C. and Gaffney B.J.: Solid State NMR 9 81-83 (1997). [21] Aasa R. and Aisen P.: J. Biol. Chem. 243 2399-2401 (1968). [22] Dubach J., Gaffney B.J., More K., Eaton G.R., and Eaton S.: Biophys. J. 59 1091-1100 (1991). [23] Fita I. and Rossman M.G.: J. Mol. Biol. 185 21-37 (1985). [24] Lemberg R. and Legge J.W.: Biochem. J. 37 117-127 (1943). [25] Rakowsky M.H., Zecevic A, Eaton G.R. and Eaton S.S.: J. Magn. Res. 131 97-110 (1998). [26] Blum H., Chance B. and Litchfield W.J.: Biochim. Biophys. Acta 534 317-321 (1978). [27] Jacob G.S. and Orme-Johnson W.H.: Biochemistry 18 2975-2980 (1979). [28] Benecky M.J., Frew J.E., Scowen N, Jones P. and Hoffman B.M.: Biochemistry 32 11929-11933 (1993). Table 1: Apparent Line Widths for Selected Metalloproteinsa X-band line width (mT)W-band line width (mT) Di-copper Lactoferrin(1.07)b11.0 ± 1.0 Di-ferric Transferrin6 ± 0.526 ± 1.0Catalase4.0± 0.252 ± 7 a Line widths reported are full widths at half height. The method by which they were determined was different in the various samples. For copper lactoferrin, values reported are for the g-parallel region and the mI -1/2 line. For ferric transferrin, the spectra are too complex to allow a simple statement about linewidths at the two frequencies to be made. The values given only allow a crude comparison to be made. The outer half width at half height for the lowest field peak arising from transition in the middle Kramers doublet was multiplied by 2 to give the values in the Table. At X-band, the maximum of the peak used was at 151mT; at W-band, the maximum at 3,261 mT was used. For catalase, the value given is 2 times the outer half width at half height in the gy feature. Errors arise from uncertainties in the baseline and noise and are estimates. Spectra were obtained at 40 K for lactoferrin and transferrin samples and at 10K for catalase samples. b The stated linewidth is calculated for mI -1/2 using values of simulation parameters given in reference 6. These same parameters predict a value of 12.5 mT for the mI -1/2 line at 94.1 GHz. FIGURE LEGENDS Figure 1. EMR spectra of di-cupric lactoferrin obtained at 40 K were recorded at X-band (9.228 GHz) and W-band (94.1402 GHz) microwave frequencies. Samples, contained in a sealed, 0.5 mm inner-diameter quartz tube, were used for measurements at both frequencies. Other instrumental parameters were, at X-band: modulation amplitude, 5 G; power, 0.2 mW; time constant, 0.128 sec; scan time, 30 min; and at W-band: modulation amplitude, 15 G; power, 3.48 mšW; sampling time, 0.655 sec; number of points, 2048. The sample used for the full spectrum was prepared with natural abundance copper. The g-perpendicular inset in the W-band spectrum was obtained with a separate sample to which 0.9 equivalents / metal-binding site of 65CuCl2 were added. Figure 2. Portions of the EMR spectra at 40 K of di-ferric transferrin carbonate are compared at X- and W-band frequencies. Instrument parameters were, X-band: frequency, 9.228 GHz; modulation amplitude, 5 G; power, 0.2 mW; time constant, 0.128 sec ; scan time, 30 min ; and, W-band: frequency, 94.090 GHz; modulation amplitude, 10 G; power, 3.2 ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööömšW; sampling time, 0.328 sec, number of points, 8192. Figure 3. The same W-band experimental spectrum of di-ferric transferrin shown in Figure 2 is shown here for the range from 1 to 5 Tesla. Figure 4. Simulations to fit the sharper component of the W-band EMR spectrum of di-ferric transferrin carbonate are shown for several widths of distributions in E. The value of D was fixed at 0.28 cm -1 and the ratio E/D was 1/3 for the center of the distribution (the value 0.0933 cm-1 given in the figure for E is at the center of the distribution). The linewidth was set at 150 MHz, although this is not the limiting factor in the apparent widths. Calculations were done at 0.5 degree increments in polar and azimuthal angles and at field increments of 1mT. The effect of the distribution in E was calculated with a Gaussian distribution over a family of 11 spectra in which E was incremented by 0.005 cm-1about 0.09333 cm-1. Figure 5. The effect of changing E and D on the resonances near 2.7 and 4 T is demonstrated. The middle spectrum is a calculation with the follwing parameters, ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööönš=94.1 GHz, T=40 K, D=0.28 cm-1, Ecentral=0.09333 cm-1, sšE=0.0244 cm-1, linewidth=150 MHz, 180 steps in theta and phi, 2000 pts along B between 1 and 5 T. The lines above the spectrum represent the position of the local resonance maximum of the 2 to 3 transition for a fixed D and varying values of E. The lines below the spectrum represent the position of the local resonance minimum of the 4 to 5 transition for a fixed D and varying values of E. Figure 6. An expansion of regions in Figure 5 is shown to illustrate how resonance positions change with E/D for transitions between levels 2 and 3 or between 4 and 5. The values of D in the lines are 0.28 cm-1 (open circles), 0.31 cm-1 (filled circles), 0.34 cm-1 (open triangles), 0.37 cm-1 (filled triangles). The ranges of E/D for the lines are 0.24393 to 0.42250 for D=0.28 cm-1, 0.25268 to 0.41397 for D=0.31 cm-1, 0.25979 to 0.40685 for D=0.34 cm-1, and 0.26576 to 0.40089 for D=0.37 cm-1. The change in the position of the resonances as a result of changing E and D are represented by arrows showing the direction of movement with increasing D or E. Figure 7. Dot plots illustrating the angular dependence of the W-band transitions between levels 2 and 3 and between 4 and 5 are shown for D=0.28 and E=0.09333 cm-1.. Figure 8. EMR spectra of bovine liver catalase precipitate are shown at X- and W-band frequencies. Both spectra were recorded at 10K. Instrument settings were, X-band: frequency, 9.244 GHz; modulation amplitude, 12.5 G; power, 2.0 mW; time constant, 0.25 sec ; scan time, 30 min ; and, W-band: frequency, 94.195 GHz; modulation amplitude 15 G; power, 15.2 OptionButton\\ProxyStubClsid&&{00020420-0000-0000-C000-000000000046}ržrTypeLib&mšW; sampling time, 0.164 sec; number of points, 8192. Signal to noise in the W-band spectrum was increased by a factor of ~2 by application of a filter. PAGE  PAGE 22 ABDŽ23TVnŪŻ¬“—šŪŻFHÅĒĘ"Č"##_)b)z,€,ˆ,Š,,’,”,–,ž,®,“,U3W3d3f3'4*4‰4‹44’4”4£4Ø4Ŗ45€5Æ5°5ļ6ņ6/707888888Ę8Č8Ō8Ų8ä8č8999 9 999999"9$9&909żöżōšōšōżīééééééääßßäääééäéäéäääääßéäßßääßäéßéäéOJQJCJEHü’CJEH>*6CJ6 CJ$OJQJCJXBCDŽnopqr®ÆTU !ż•¬ ® Ä Å łńłłłłģģģģģģģģģģååłģģģģģģģ„|üdądą$„ąüdą$dąBCDŽnopqr®ÆTU !ż•¬ ® Ä Å ‹%9("-J.Ą1Ų1Ł1ų8ś8’9”9::0AHLNMNyNzNHUu]†bpppĖuƒx„x•x–xöx÷xųx¼y’yjzĖzG{”{|›|Ś|#}}Į}~:~œ~ż~sæ€J€Š€ķ€,kĒ ‚i‚ ƒƒƒƒƒ(ƒ?ƒ@ƒAƒBƒXƒ`ƒlƒżżżūżżż cÅ ‹%9("-J.Ą1Ų1Ł1ų8ś8’9”9::0AHLNMNyNzNHUu]†bpppĖuƒx„xśśśśśśśśśśśśśśśśśšśśśśśśśśśś dą ĘŠšdą094969<9@9B9J9L9R9\9d9f9l9n9p9°9²9¼9Ä9Ģ9Ī9ą9ä9ģ9ō9 ::²:“:ŗ:< <Q=R=`=a=3>5>3B6BOFPFSFTFZF[FpKtK L"LNN{ˆ{“{č{ź{„|†|Č|Ė|}}k}m}°}²}ż}~%~'~‹~Œ~ź~ķ~^`óõ:€;€t€w€×€Ł€ė€ģ€XZ³¶ ‚‚T‚V‚¹‚»‚Š‚Ń‚ ƒƒƒ?ƒBƒWƒ^ƒ_ƒqƒ†ƒƒ„ƒ“„”„Į†Ā†«‡¬‡(ˆ)ˆ0Š2Š'Œ)Œ-Œ.ŒŽŽįūūłłłł÷÷łłłłłł÷łłłłłłłł÷łłłłłł÷ūõõūõõššššėūšėūOJQJCJEHü’>*65CJEH]„x•x–xöx÷xųx¼y’yjzĖzG{”{|›|Ś|#}}Į}~:~œ~ż~sæ€J€Š€ķ€,śś÷õõśśśśśśśśśśśśśśśśśśśśśśś$dą,kĒ ‚i‚ ƒƒƒƒƒ(ƒ?ƒ@ƒAƒBƒXƒ`ƒlƒmƒnƒoƒpƒqƒ‡ƒƒ˜ƒ™ƒśśśśśųųõšššįõõšššįšššį šššį$$–P4Ö °’ą @$$$$dąlƒmƒnƒoƒpƒqƒ‡ƒƒ˜ƒ™ƒšƒ›ƒœƒƒ¦ƒÆƒ¶ƒ·ƒøƒ¹ƒŗƒ»ƒ¼ƒ½ƒ€‡‡AˆQˆRˆ;Œ<ŒpŽrŽ†ˆ ’”’Ā–Ć–V™W™ž™’™46@DFHJLdfhjlžūūūžūūūžūūūžūūūžūūūžłłłłłł÷÷łł 7™ƒšƒ›ƒœƒƒ¦ƒÆƒ¶ƒ·ƒøƒ¹ƒŗƒ»ƒ¼ƒ½ƒ€‡‡AˆQˆRˆ;Œ<ŒpŽrŽ†ˆ ’śśśėhśśśėśśśėēāāāāāāāāāāāāādą„p$$–P4Ö °’ą @$$$įä‰’‹’›’’””:”>”D”R”h”l”p”r”ˆ”Œ”“—•—­—Æ—É—Ė—å—ē—@˜B˜d˜f˜ˆ˜Š˜°˜²˜ł™ū™œœ68DFHLNZ\`bdlūūūöńģéöńńńńńńńńńūöāßāßāßāŚāß0JmH0J j0JUCJCJEHü’CJEHOJQJCJEH2 ’”’Ā–Ć–V™W™ž™’™46HJLdfhjlśōōōōōśśśčęäčęääś $&#$„ē„O9„@$dądą# 0P°Š/ °ą=!° "° # $ %°|HHH’ō’ņ VG(üHHHd `-C000-000000000046}GroupBox\µ\ProxyStubClsid&&{00020420-0000-0000-C000-000000000046}r¶rTypeLib&&{00020813-0000-0000-C000-000000000046}Version1.2X·X&&{0002088A-0000-0000-C000-000000000046} GroupBoxes\ø\öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö  !"#$%&'()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[\]^_`abcdefghijklmnopqrstuvwxyz{|}~€‚ƒ„…†‡ˆ‰Š‹ŒŽ‘’“”•–—˜™š›œžž’’’ ”¢£¤„¦ž’’’ż’’’ż’’’Ŗ±ž’’’­®Æ°²³“»µ¶·ø¹ŗž’’’ž’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’Root Entry’ž’’’ž’’’ž’’’ž’’ ’ž’’ ’’’’’’’’ ĄFæŖ9Ćč½¬Ą Data$%&'()*+,-.’ž’’’’’’ ’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’Ÿ’’’’WordDocument’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’ ’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’”<’’’’ObjectPool’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’€ĪÆ6Ćč½æŖ9Ćč½’’’’’’’’’’’’_968260500’’’’’’’’ĪĄF€ūą7Ćč½€ūą7Ćč½Ole ’’’’’’’’’’’’PIC ’’’’TPICT ’’’’’’’’’’’’©ž’’’ž’’’  !"#$%ž’’’'ž’’’ž’’’ž’’’+,-ž’’’ž’’’012345ž’’’789:;<=ž’’’?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[\]^_`ž’’’bž’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööT6+Ģččöööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö©Ō”d·xpr ”ņMTHUŌGr‰phÆbj Œ Ō"Ō ¾”Ą currentpoint  æ" ¾,Times .+ ö (H , Symbol) =) g)b) B) ×)S) +) D) S +z( ^2 + - ( q1* 3" p (xS ( ~2  (P()5)(‹+) E) S +x( ¬2 +-) S +y( É2  (œ()3)”Ąö/MTsave save def 40 dict begin currentpoint 3 -1 roll sub neg 3 1 roll sub 6784 div 736 3 -1 roll exch div scale currentpoint translate 64 61 translate /thick 0 def /th { dup setlinewidth /thick exch def } def 16 th 3547 320 moveto 187 0 rlineto stroke /cat { dup length 2 index length add string dup dup 5 -1 roll exch copy length 4 -1 roll putinterval } def /ff { dup FontDirectory exch known not { dup dup length string cvs (|______) exch cat dup FontDirectory exch known {exch} if pop } if findfont } def /fs 0 def /cf 0 def /sf {exch dup /fs exch def dup neg matrix scale makefont setfont} def /f1 {ff dup /cf exch def sf} def /ns {cf sf} def /sh {moveto show} def 384 /Times-Roman f1 (\303) 115 312 sh 384 /Times-Italic f1 (H) 9 419 sh (g) 716 419 sh (D) 2235 419 sh (S) 2644 419 sh (E) 4708 419 sh (S) 5093 419 sh (S) 6024 419 sh 319 ns (z) 2827 515 sh (x) 5285 515 sh (y) 6215 515 sh 384 /Symbol f1 (=) 401 419 sh (\327) 1492 419 sh (+) 1923 419 sh (-) 3246 419 sh /f3 {ff 3 -1 roll .001 mul 3 -1 roll .001 mul matrix scale makefont dup /cf exch def sf} def 384 1000 1937 /Symbol f3 (\() 2502 499 sh (\)) 4201 499 sh 384 /Symbol f1 (+) 4400 419 sh (-) 5726 419 sh 384 1000 1768 /Symbol f3 (\() 4951 484 sh (\)) 6573 484 sh /f2 {ff matrix dup 2 .22 put makefont dup /cf exch def sf} def 384 /Symbol f2 (b) 908 419 sh 384 /Times-Bold f1 (B) 1189 419 sh (S) 1636 419 sh (S) 3782 419 sh 319 /Times-Roman f1 (2) 2971 278 sh (1) 3560 280 sh (3) 3565 576 sh (2) 3999 247 sh (2) 5451 278 sh (2) 6371 278 sh end MTsave restore  æ”dŌMATHČŽ 2ƒH †=ƒg„b˜‡B†×‡S†+ƒDƒS ƒz  ˆ2 †- ˆ1ˆ3 ‡S ˆ2 –(–)†+ƒEƒS ƒx  ˆ2 †-ƒS ƒy  ˆ2 –(–) ’öööööööööööööööööööööööž’’’’’ĪĄFMicrosoft Equation 3.0ž’’’1ELO Equation.3ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööCompObj ’’’’&RObjInfo’’’’’’’’’’’’(OlePres000 ’’’’)(Ole10Native’’’’ ’’’’*Ģööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööž’’’’’’’ööööööööööööööööööööööööČ 2ƒH †=ƒg„b˜‡B†×‡S†+ƒDƒS ƒz  ˆ2 †- ˆ1ˆ3 ‡S ˆ2 –(–)†+ƒEƒS ƒx  ˆ2 †-ƒS ƒy  ˆ2 –(–)öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö Equationöööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööž’ ą…ŸņłOh«‘+'³Ł0TˆOle10FmtProgID ’’’’’’’’’’’’. 1Table’’’’>¹SummaryInformation(’’’’/„DocumentSummaryInformation8’’’’’’’’’’’’6ȐœØ“ĄŠ čō   (4<DL'ososososNormalfBetty Gaffneyo2ttMicrosoft Word 8.0d@@~ _PID_GUID'AN{64DAAF00-54B6-11D2-AC3B-000502D38DAF}öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö [0@ń’0NormalCJOJQJmH <A@ņ’”<Default Paragraph Font, @ņ,Footer  ĘąĄ!&)@¢& Page Number><%<’’’’’’’’’’’’’’’’’’ ’’ ’’ ’’ ’’ ’’’’’’’’’’’’’’’’’’ÉŠM­į$Į,y4A>ļF”P‹ZcdOgŠo8péuz册Ž>4 _°‹ ¦ ! Å ķ  a<Ÿ– 09”nįl’–—œÅ „x,™ƒ ’l“•˜™›lƒl”š›E¾EĄE>:”’•€ !•!’•€"#.9?"#.9?’’ Betty GaffneyUntitled:IERC.. paper’@€R& Fąø()M2M3M4MBMCMM‚äƒä„%ˆ%‰ˆŽ>P@P,P\@P8P:Px@PJP˜@PŠP@PŽP @P”P,@PœGTimes New Roman5€Symbol3 Arial;Helvetica9MNew York3Times"€ŠĶ)¦Ķ)¦“v<ƒū$€+„šˆ’’ Betty Gaffneyöööööööž’’’’’ ĄFMicrosoft Word Documentž’’’NB6WWord.Document.8ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööCompObj’’’’’’’’’’’’aX’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’